提高顯微鏡的分辨率

顯微鏡作為檢測(cè)設(shè)備的主要設(shè)備之一，而評(píng)判顯微鏡性能的重要指標(biāo)是分辨率。分辨率是指能清楚地分辨兩個(gè)小點(diǎn)或兩線間的最小距離。人眼本身就是一臺(tái)顯微鏡，在標(biāo)準(zhǔn)照明條件下，人眼在明視距離（國(guó)際公認(rèn)為25cm） 上的分辨率約等于1/ 10mm。對(duì)于觀察兩條直線來(lái)說(shuō)，由于直線能刺激一系列神經(jīng)細(xì)胞，眼睛的分辨率還能提高一些。

人眼的分辨率只有1/ 10mm， 那么比1/ 10mm 小的物體或比1/ 10mm 近的兩個(gè)微小物體的距離，人眼就無(wú)法分辨了。所以出現(xiàn)了從簡(jiǎn)單的宏觀放大鏡到微觀觀測(cè)的光學(xué)顯微鏡，繼而電子顯微鏡。顯微鏡的分辨率定義是指在標(biāo)本上能清楚分辨的兩個(gè)小點(diǎn)之間的最小距離。其計(jì)算公式為：

D=0.61λ／NA

式中：D 為分辨率（um）；λ 為光源波長(zhǎng)（um）；NA 為物鏡的數(shù)值口徑（也稱鏡口率）。

由公式可得到，顯微鏡的分辨率決定于入射光源的波長(zhǎng)以及所匹配物鏡的數(shù)值孔徑。由此可知，提高光學(xué)顯微鏡的方法：

1、降低光源波長(zhǎng)。

可見(jiàn)光最短波長(zhǎng)為390nm,若用此波長(zhǎng)的紫外光作為照明光源，可使光學(xué)顯微鏡的分辨率降低至0.2um。但是由于大多數(shù)普通材料的玻璃會(huì)大量吸收340nm以下波長(zhǎng)的光，紫外光經(jīng)過(guò)大量衰減無(wú)法形成清晰、明亮的圖像。因此不得不使用石英(可透過(guò)低達(dá)200nm的紫外光)、熒石(可透過(guò)低達(dá)185nm的紫外光)等價(jià)格昂貴的材料，并且紫外光顯微鏡不能用肉眼進(jìn)行觀察，甚至受觀測(cè)樣品的限制，再加上昂貴的造價(jià)，所以這種提高顯微鏡分辨率的方式由于其自身的局限性而不受廣泛應(yīng)用。

2、增加物鏡的數(shù)值孔徑NA.

數(shù)值孔徑NA=n*sin(u)

式中，n為物鏡與標(biāo)本之間的介質(zhì)折射率；u為物鏡的二分之一孔徑角。因此，從光學(xué)設(shè)計(jì)上適當(dāng)采用較大的孔徑角，或者增大折射率成為最常見(jiàn)的提高光學(xué)顯微鏡分辨率的方法。一般低倍物鏡如10X以下其介質(zhì)采用空氣，折射率為1，即干燥系物鏡；水浸介質(zhì)是蒸餾水，其折射率為1.33；油浸物鏡介質(zhì)是香柏油或其它透明油，其折射率一般在1.52 左右，接近透鏡和載玻片的折光率，如Olympus 的100X油鏡。水浸物鏡和油浸物鏡不僅放大倍數(shù)高而且由于使用高折射率的介質(zhì)，從而提高物鏡的分辨率。